Tách chiết tự động DNA từ mẫu thực phẩm

Giới thiệu

Chất lượng thực phẩm và những tác động của nó đối với sức khỏe đang ngày càng được quan tâm. Cùng với đó là các vụ bê bối liên quan tới thực phẩm bẩn thúc đẩy các nhà cung cấp trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm chứng minh chất lượng sản sản của mình. Một trong các vấn đề là nguồn gốc nguyên liệu: có hay không việc sử dụng thực phẩm biến đổi gen (GMO)?

Một phương pháp hiệu quả được sử dụng hiện nay dựa trên nền tảng cơ sở di truyền là Chuỗi phản ứng trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR) với độ nhạy cao. Để PCR đạt hiệu quả, DNA tách chiết từ thực phẩm phải đạt số lượng và chất lượng nhất định là yếu tố bắt buộc. Một số loại mẫu (như mẫu thực vật, thực phẩm đã chế biến…) có chứa một lượng đáng kể các chất ức chế phản ứng PCR sau này, gây trở ngại cho quá trình phân tích.

Trong thí nghiệm được mô tả dưới đây, DNA được tách chiết từ mẫu tôm, hạt phỉ và hai loại phô mai sử dụng bộ hai bộ hóa chất innuPREP DNA Kit-IPC16 và innuPREP Food DNA Kit-IPC16 thực hiện trên thiết bị InnuPure C16 touch. Mẫu sau khi nghiền đồng nhất và ly giải sẽ được đưa vào các đĩa hóa chất, đĩa hóa chất được đưa vào máy, quá trình tách chiết DNA tự động dựa trên nguyên lý hạt từ được bắt đầu.

Sau khi tách chiết, chất lượng DNA sẽ được sẽ được phân tích bằng ba kỹ thuật: điện di gel agarose (thiết bị điện di Compact), đo độ hấp thụ tại các bước sóng đặc trưng (máy quang phổ đo nồng độ acid nucleic/protein Scandrop2/Scandrop 250) và real time PCR định lượng (máy real-time PCR qTower3).

Các kit tách chiết chứa các hóa chất và đệm được phân chia sãn trên các đĩa, dây ống cùng protocol tách chiết tự động trên thiết bị đã giúp giảm quá trình thao tác bằng tay xuống mức tối thiểu. Nên cạnh lợi ích về tiết kiệm thời gian, các bộ kit tách chiết tự động cũng giúp giảm tối đa sai số do các lỗi con người và các lỗi mất mẫu. Kết quả phân tích bằng điện di gel, quang phổ và real-time PCR định lượng cho thấy: DNA  tách chiết bằng hóa chất và thiết bị từ Analytik Jena lý tưởng cho các ứng dụng tiếp theo.

Vật liệu và phương pháp

Mẫu tôm đông lạnh (50mg) nghiền đồng nhất trong 200µl H2O – 15 s, sử dụng SpeedMill PLUS và Lysis Tubes P (Analytik Jena). Hỗn hợp đồng nhất được trộn với 200 µl Lysis Solution CBV và 20 µl Proteinase K, ủ tại 50 °C – 600 rpm – 60 phút. 400 µl hỗn hợp ly giải được chuyển sang đĩa hóa chất của innuPREP DNA Kit- IPC16 và được tách chiết với InnuPure® C16.

100 mg và 200 mg hạt phỉ nghiền được trộn với 800 µl Lysis Solution CBV và 20 µl Proteinase K. Mẫu được ly giải 60 phút – 65 °C. Sau khi ly giải, 400 µl dịch nổi được sử dụng cho quá trình tách chiết sử dụng bộ hóa chất innuPREP Food DNA Kit- IPC16 và thiết bị InnuPure® C16.
DNA được tách ciết từ hai loại phomai được công bố có nguồn gốc từ sữa dê và bò. Quá trình tách chiết được thực hiện 4 lần sử dụng InnuPure® C16 touch và innuPREP Food DNA Kit- IPC16 từ 200 mg phomai. Thế tích DNA cuối cùng được cài đặt là 100 µl. Sau tách chiết, DNA được kiểm tra chất lượng với máy quang phổ Scandrop 250 và qRT-PCR qTOWER3 kết hợp bộ hóa chất innuDETECT Cheese Assay (Analytik Jena).

Mẫu và hóa chất

• innuPREP DNA Kit-IPC16 (Analytik Jena)
• innuPREP Food DNA Kit-IPC16 (Analytik Jena)
• Lysis Tubes P (Analytik Jena)
• innuDETECT Cheese Assay (Analytik Jena)
• Bộ hóa chất phân tích hạt phỉ

Thiết bị

• InnuPure® C16 touch (Analytik Jena)
• SpeedMill PLUS (Analytik Jena)
• BioShake iQ (Analytik Jena)
• ScanDrop® 250/Scandrop2 (Analytik Jena)
• Thiết bị điện di và chụp ảnh gel (Analytik Jena)
• qTOWER3 G (Analytik Jena)

Kết quả và thảo luận

DNA sau khi tách chiết từ mẫu tôm đông lạnh sẽ được phân tích chất lượng và tính toàn vẹn sử dụng máy quang phổ và điện di gel agarose.
Bảng 1: Kết quả phân tích bằng máy quang phổ DNA tách chiết từ mẫu tôm

Kết quả phân tích, DNA tinh sạch có tỷ lệ A260/A280 nằm trong dải 1.87 tới 2.32. Hiệu suất trung bình là 22.1ng/µl  đáp ứng nhu cầu cho các ứng dụng PCR

Hình ảnh điện di chỉ ra: một phần DNA đã bị thoái hóa thể hiện qua các vệt smear trên lane 2-5. Quá trình thoái hóa là sự tất yếu xảy ra khi động vật chết và chỉ dừng lại khi đông lạnh. Bên cạnh DNA thoái hóa, một lượng lớn DNA kích thước lớn xuất hiện tạo một băng lớn hơn 1500 bp.
DNA sau khi tách chiết từ 100mg và 200mg bột hạt phỉ sẽ được phân tích qRT-PCR Để phát hiện các chất ức chế trong DNA đã tách chiết, dung dịch sẽ được pha loãng 1:10 và tiến hành khuếch đại 1 µl dung dịch không và đã pha loãng.

Hình 2 và hình 3 cho thấy DNA tách chiết từ hạt phỉ đạt yêu cầu cho phản ứng PCR. Tách chiết DNA từ mẫu chứa hàm lượng lipid cáo là một thách thức vì sản phẩm tách chiết có thể chứa sản phẩm ức chế PCR.

DNA tách chiết từ 200 mg pho mai được đo với ScanDrop 250 và qRT-PCR. qTOWER3 kết hợp innuDETECT Cheese Assay. Kết quả phân tích trên phần mềm qPCRsoft

Kết quả cho thấy, sự kết hợp của InnuPure® C16 touch  và innuPREP Food DNA Kit-IPC16 đảm bảo khả năng tách tách chiết DNA từ phomai cho các ứng dụng qRT-PCR application. Kết quả tách chiết duy trì nồng độ DNA từ 9-16 ng/µl cũng như protein được loại bỏ hoàn toàn, thể hiện ở tỷ lệ A260/A280 trong bảng 2. Kết quả: chỉ phát hiện DNA dê trong mẫu phomai được công bố nguồn gốc từ sữa dê, : chỉ phát hiện DNA bò trong mẫu phomai được công bố nguồn gốc từ sữa bò, không phát hiện DNA cừu trong cả hai loại phomai.

Tổng kết

Các kết quả thí nghiệm chỉ ra rằng: sự kết hợp của InnuPure® C16 touch và các bộ kit tách chiết DNA cho thiết bị này có thể sử dụng cho các mẫu thực phẩm trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm. DNA tách chiết đạt chất lượng tối ưu và lý tưởng cho ứng dụng qRT-PCR.