REAL-TIME PCR (qPCR) – Ứng dụng lâm sàng

Công nghệ PCR là gì?

Công nghệ PCR được ra phát minh vào năm 1984 bởi Kary Mullis đã tạo nên một cuộc cách mạng khoa học. Trên nền tảng đó, real-time PCR ra đời và cho đến nay đã trở thành một công cụ mạnh mẽ, ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng.

So với PCR truyền thống, real-time PCR vẫn khuếch đại DNA sử dụng Taq polymerase, mồi, dNTPs kết hợp chu trình nhiệt tối ưu. Tuy nhiên, thay vì thực hiện các bước sau PCR (điện di, lai đặc hiệu), real-time PCR sẽ cho kết quả khuếch đại DNA ngay sau mỗi chu trình nhiệt. Chìa khóa của tính ưu việt trên chính là chất huỳnh quang được thêm vào realtime PCR mix.

Chất huỳnh quang này có thể ở dạng chèn sợi đôi DNA hoặc dạng đầu dò. Trong ứng dụng lâm sàng, công nghệ đầu dò Taqman được sử dụng phổ biến nhất. Đầu dò Taqman là các nucleotide có trình tự bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA đích, có đầu 5’ gắn chất phát huỳnh quang (reporter) và đầu 3’ gắn chất hấp phụ huỳnh quang (quencher). Trong quá trình khuếch đại DNA, enzyme Taq Polymerase sẽ thủy phân đầu dò, làm quencher rời xa reporter, reporter sẽ phát huỳnh quang phát xạ khi được kích thích. Lượng DNA được khuếch đại càng nhiều, tín hiệu huỳnh quang thu được sẽ càng mạnh.

Nhờ đó, so với PCR truyền thống, real-time PCR có các ưu điểm:

• Quá trình khuếch đại và phát hiện DNA đích thực hiện trong 1 bước trên một thiết bị giúp tiết kiệm thời gian
• Dải động học rộng cho phép phát hiện DNA đích nồng độ đa dạng
• Có thể phân tích lượng mẫu mô, mẫu sinh thiết nhỏ
• Độ tái lặp lại cao

Các ứng dụng chẩn đoán lâm sàng bằng kỹ thuật real-time PCR:

1.    Định lượng biểu hiện gen (RT – qPCR)

Định lượng biểu hiện mRNA là một trong những ứng dụng quan trọng nhất của qPCR. Mỗi xét nghiệm chẩn đoán đòi hỏi được tối ưu: chất lượng RNA tách chiết, lựa chọn và chuẩn hóa gen giữ nhà (housekeeping gene), quá trình chuẩn bị mẫu và phân tích kết quả.
Ví dụ cho ứng dụng này, RT-qPCR là tiêu chuẩn vàng đánh giá biểu hiện của cytokine và chemokine. Cytokine là một nhóm lớn các protein trọng lượng phân tử thấp, được tiết ra bởi nhiều loại tế bào khác nhau, đóng vai trò trung tâm trong việc điều chỉnh các phản ứng miễn dịch. Do đó, mức độ biểu hiện cytokine bất thường sẽ góp phần gây ra các rối loạn miễn dịch, chẳng hạn như bệnh tự miễn, dị ứng và viêm hoặc đào thải cấy ghép. Các chemokine là một nhóm nhỏ của các cytokine có chức năng như các chất hấp dẫn hóa học, kiểm soát việc tập hợp bạch cầu đến các vị trí mô tổn thương mô.
Trong các bệnh tự miễn, như tiểu đường type 1, việc di chuyển và tập trung các tế bào miễn dịch tới cơ quan đích là một bước quan trọng trong theo dõi tình trạng bệnh.
Việc định lượng biểu hiện cytokine và chemokine tại các cơ quan, mô đích là nền tảng quan trọng để hiểu rõ về các bệnh viêm và theo dõi điều trị bệnh.

2. Vi sinh lâm sàng

qPCR là công cụ rất hiệu quả định lượng (đo tải lượng) vi khuẩn và virut, cũng như nấm, ký sinh trùng, động vật nguyên sinh (tuy với lượng ít hơn) với độ nhạy cao hơn, thời gian phát hiện nhanh hơn so với phương pháp nuôi cấy truyền thống. Việc định lượng nhanh chóng có ý nghĩa rất quan trọng cho xác định tình trạng nhiễm trùng và theo dõi trong quá trình điều trị.

Một ứng dụng quan trọng khác là định lượng vector chuyển gen trong liệu pháp gen. Coi điều trị bằng liệu pháp gen là một hệ thống phân phối thuốc, hai thông số quan trọng cần được đánh giá: 1) Mức độ biểu hiện của gen điều trị và 2) Sự phân bố thuốc ở các cơ quan khác nhau. Việc kiểm soát hai thông số này bằng kỹ thuật real-time PCR đã được chứng nhận, đảm bảo độ nhạy và và độ chính xác cho xét nghiệm.

3. Ung thư lâm sàng

Trong lĩnh vực ung thư lâm sàng, kỹ thuật real-time PCR được tối ưu cho phát hiện bệnh tồn dư tối thiểu (minimal residual disease – MRD), hiện tượng đa hình đơn nucleotide (SNPs) và chuyển đoạn nhiễm sắc thể.

Tổng kết

Kỹ thuật realtime PCR có ý nghĩa rất lớn trong việc định lượng DNA, RNA trong chẩn đoán lâm sàng nhanh chóng, chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao.